Одна из важнейших особенностей метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) это его высокая чувствительность. В тоже время, это является и его основной слабостью, которая ведет к получению ложноположительных результатов из-за экзогенных загрязнений. Таким образом, предотвращение загрязнения (контаминации) является самым важным аспектом при создании лаборатории ПЦР, особенно для диагностических целей. Во многих ситуациях, меры предосторожности, которые обычно применяются при обращении с микробиологическими материалами, в равной степени применимы к процедурам, связанным с ПЦР.
Источники загрязнения
Существует четыре основных источника загрязнения ПЦР. Самым важным является продукт ПЦР из предыдущих амплификаций, так называемое загрязнение переноса. Из-за огромной мощности амплификации ПЦР и ее способности генерировать до 1012 молекул продукта в одной реакции, это самый серьезный источник загрязнений. Когда такое большое количество продукта генерируется неоднократно в течение определенного периода времени, вероятность контаминации становится все более высокой. Это дополнительно усугубляется тем фактом, что многие диагностические приложения требуют от ПЦР чувствительности на уровне одной молекулы. В этих условиях даже одной из миллиардов молекул, генерируемых из одной реакции, достаточно для создания ложноположительного результата. Второй источник загрязнения - это клонированная ДНК, ранее обработанная в лаборатории. Третий тип - это загрязнение образца. Этот источник загрязнения наиболее вреден для образцов, которые требуют интенсивной обработки до амплификации. Четвертым источником является повсеместно присутствующая матричная ДНК в окружающей среде.
Принципы предотвращения контаминации
Основными принципами предотвращения заражения в ПЦР являются:
- Строгое физическое разделение лаборатории на участки. Рекомендуется использовать три различные рабочие области, используемые для: стадии подготовки образца, стадии постановки ПЦР и стадии обработки данных. Используемые на каждом этапе приборы и лабораторное оборудование также должны быть разделены по областям. Этот принцип относится не только к приборам, но и к компьютерам и другим принадлежностям.
- Правильная организация рабочего процесса позволит минимизировать риск контаминации. Для этого все используемые реагенты должны быть автоклавированы, если это допускается. Обязательно использование и частая смена перчаток. Желательно также использовать лицевые маски. Идеальным является использование дозаторов с положительным вытеснением, если таких нет, используются наконечники с фильтром, защищающим конус дозатора от аэрозольных загрязнений. Старайтесь сводить к минимуму число циклов ПЦР, поскольку высокочувствительные анализы более подвержены загрязнению. Предпочтительно использование одноразовых предметов, таких как пластиковые пробирки, наконечники дозаторов и другие емкости. Если вам позволяет финансовое положение, следует разделить персонал для части проведения ПЦР и обработки данных. Если этого сделать нельзя, постарайтесь организовать рабочий процесс так, чтобы процедуры проведения ПЦР и обработки данных выполнялись в разные дни. Использование закрытых ПЦР-систем, например системы TaqMan®, позволяет проводить анализ на основе флуореснценции продуктов реакции. Это позволяет исключить перекрестное загрязнение, возникающее при открытии сосудов.
Обнаружение загрязнений
Мониторинг загрязнения, вероятно, так же важен, как и меры по его предотвращению. В обычной практике загрязнения возникают если не у все, то у большинства исследователей. Для облегчения мониторинга загрязнения необходимо предпринять следующие меры:
Отрицательный контроль должен быть включен в каждый эксперимент. Должны быть включены различные отрицательные контрольные образцы, проверяющие этапы процесса ПЦР, при которых может произойти загрязнение. ПЦР-реагенты будут проверяться только на загрязнение в процессе исследования, но не на стадии подготовки образца.
В некоторых видах исследований продукты ПЦР из разных образцов будут иметь разные последовательности, например, вариации последовательности в бактериях, происходящие в разное время. В этих ситуациях секвенирование продуктов ПЦР или методов, которые отражают вариабельность последовательности, например, гетеродуплексный анализ и анализ полиморфизма односвязных полиморфизмов (SSCP), полезны при проверке подлинности положительного результата.
Заключение
Контаминация является единственным наиболее важным препятствием для использования ПЦР в диагностических целях. Загрязнения можно избежать только путем тщательного соблюдения правил организации процесса. В сочетании с системами мониторинга, предназначенными для обнаружения загрязнений, высокая чувствительность ПЦР перестает быть серьезной проблемой и становится ее преимуществом.